Handbook of process chromatography : development, manufacturing, validation and economics

Preface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv Acknowledgements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii 1 Biopharmaceuticals Today . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1 Industrial Context. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Overview of Biopharmaceutical History . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.1 Protein drugs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.2.2 Vaccines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 1.3 Biopharma Business Environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.3.1 Biopharma pipeline: the promise. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.3.2 Launched biopharmaceuticals: delivering on promises . . . . . . . . . . . . . . 7 1.3.3 Chromatography products used for making biopharmaceuticals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.4 Key Business Issues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.4.1 Prime challenge, time and cost of new drug development . . . . . . . . . . . . 10 1.4.2 Other significant business challenges . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.4.3 Biosafety and general drug safety issues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 1.4.4 Regulatory issues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 1.5 Process Chromatography within an Industrial Context . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.5.1 High-level managerial strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.5.2 Development project throughput . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.5.3 Manufacturing strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.5.4 Technology platforms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.5.5 Constraints on technology and product choices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 1.6 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2 Process Capability and Production Scenarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1 Process Capability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1.1 The process scientist’s perspective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1.2 The production manager’s perspective. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.1.3 How much product needs to be made? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2 Production Setups. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.2.1 Production setup for several hundred grams up to ten-kilogram scale. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.2.2 Production setup for several tens of kilograms up to multi-ton scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Upstream process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Downstream process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 2.2.3 Multi-product facilities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 v 2.3 Process Capability Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3 Process-Design Concepts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.1 Typical Process Design for Biopharmaceuticals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 3.2 Management Framework for Process Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.2.1 Defining structure and workflow for process design . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.3 Production Cells and Typical Product Characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.3.1 Production cells and their selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 Mammalian cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 Yeast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Filamentous fungi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Insect cells. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Transgenic plants. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Transgenic animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 3.3.2 Typical impurity profiles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Product-related impurities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Process-related impurities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52 3.3.3 Knowing the target molecule and its stability window. . . . . . . . . . . . . . . 54 3.4 Risk Analysis and Risk Mitigation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 3.4.1 Categories of risks, prioritization and mitigation strategies . . . . . . . . . . . 56 3.4.2 Mitigation of safety risks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58 3.5 Downstream Processing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.5.1 Recovery process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.5.2 Purification process. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Selection of industrial raw materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 3.5.3 The Capture, purification, polishing (CPP) concept . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Capture stage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 Purification stage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 Polishing stage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.5.4 Process integration, combining steps for an efficient process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.6 Selected Downstream Processing Platform Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 3.6.1 Monoclonal antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 3.6.2 Plasmid DNA (pDNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 3.7 Characterizing the Process, Process Understanding. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 3.7.1 Design space concept, ICH Q8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 3.7.2 Statistical design of experiments (DoE). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 3.7.3 Process characterization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4 Separation Technologies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.2 Recovery . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.2.1 Centrifugation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 4.2.2 Filtration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 vi Contents 4.2.3 Other techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 Fluidized beds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Protein crystallization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 4.3 Purification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.3.1 Design principles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.3.2 Chromatography resins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.3.3 Selectivity and productivity of some popular chromatographic techniques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 Size exclusion chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Ion exchange chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 Reversed phase chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Hydrophobic interaction chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106 Affinity chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Other modes of chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 4.3.4 Scale-up of chromatographic purifications. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 Guidelines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 System factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 Examples of scale-up. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 Non-chromatographic scale factors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 4.3.5 Ultrafiltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118 Optimization of ultrafiltration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 4.3.6 Virus filters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 4.4 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 4.5 Selecting Tools from R&D to Production . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122 5 Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.2 Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.2.1 Identity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127 5.2.2 Purity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 Structural analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Process impurities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130 Contaminants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 5.2.3 Quantity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 5.2.4 Potency. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 5.2.5 Stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 5.2.6 Assays for monoclonal antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135 5.3 Nucleic Acid Products . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.3.1 Identity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 5.3.2 Purity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136 Process impurities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137 Contaminants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 5.3.3 Quantity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 5.3.4 Potency. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 5.3.5 Stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 5.4 Comparability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 5.5 Setting Specifications and Reference Standards . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140 Contents vii 5.6 Method Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 5.7 Process Analytical Technologies (PAT). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142 6 Cleaning and Sanitization. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 6.2 Cleaning. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 6.2.1 Resins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 6.2.2 Filter media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 6.2.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152 6.3 Decontamination of Transmissible Spongiform Encephalopathy Agents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 6.3.1 Resins and filter media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 6.3.2 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 6.4 Sanitization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154 6.4.1 Resins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 6.4.2 Filter media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 6.4.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158 7 Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 7.1.1 Validation terminology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 7.2 What to do When? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 7.2.1 Toxicology studies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 7.2.2 Human clinical trials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 7.3 Validation of Downstream Processes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 7.3.1 General considerations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 7.3.2 Raw materials and process tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Acceptance criteria for chromatography resins. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 7.3.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Equipment qualification. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168 Installation qualification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169 Operational qualification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 Automated equipment qualification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170 Column packing and qualification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 7.3.4 Process validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172 Storage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 Leachables. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 Cleaning and sanitization validation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Resin and membrane lifetime . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 Small and manufacturing scales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182 Clearance studies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 7.4 Making Changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 7.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Acknowledgements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186 viii Contents 8 Economics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189 8.1 Economics: An Educational Excursion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 8.1.1 Costs as seen from a corporate level . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 8.1.2 Costs as seen from a manufacturing management level . . . . . . . . . . . . . . 192 8.1.3 Costs as seen with an interesting novel technology in mind . . . . . . . . . . 196 8.2 LEAN Manufacturing, Removal of Unproductive Activities . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 8.3 Cost Model: Monoclonal Antibody Downstream Process . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 8.4 Cost Improvement Options . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 8.4.1 Facility utilization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202 8.4.2 Cell culture: product titer and culture time . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 8.4.3 Process yield. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 8.4.4 Use of the latest resin technology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208 8.4.5 Re-use strategies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 8.4.6 Buffer consumption and cleaning buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 8.4.7 Exchange of one step against a cheaper one . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212 8.5 Impact from R&D, Platform Strategies and Technology Outlook . . . . . . . . . . . . . 214 8.6 Conclusions, the Improvement Hierarchy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 9 Basic Properties of Peptides, Proteins, Nucleic Acids and Virus Particles . . . . . . . . . 219 9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219 9.2 Peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219 9.2.1 Amino acid composition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 9.2.2 Structure of peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.2.3 Surface properties of peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.2.4 Characterization methods of peptides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221 9.3 Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 9.3.1 Structure of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222 9.3.2 Surface properties of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 9.3.3 Characterization methods of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226 9.3.4 Properties of human antibodies and antibody fragments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226 9.4 Nucleic Acids. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 9.4.1 Basic structure of DNA and RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228 9.4.2 Surface properties of nucleic acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229 9.4.3 Characterization methods of nucleic acids. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230 9.5 Viruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 9.5.1 Structure of virus particles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231 9.5.2 Surface properties of virus particles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 9.5.3 Characterization methods for virus particles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234 10 Optimization of Chromatographic Separations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237 10.2 Basic Relationships . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 10.2.1 Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238 10.2.2 Retention . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239 Contents ix 10.2.3 Zone broadening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 10.2.4 Mass transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243 10.2.5 Flow resistance of packed beds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243 10.3 Purification Principles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 10.3.1 Gel filtration/size exclusion chromatography, SEC . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 Retention in SEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245 Zone broadening in SEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247 Resolution in SEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 Influence of experimental parameters in SEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248 10.3.2 Ion exchange chromatography, IEC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 Retention in IEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252 Zone broadening in IEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253 Resolution in IEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 Influence of experimental parameters in IEC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254 10.3.3 Reversed-phase chromatography, RPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 Retention in RPC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 Zone broadening in RPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258 Resolution in RPC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259 Influence of experimental parameters in RPC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259 10.3.4 Hydrophobic interaction chromatography, HIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 Retention in HIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 Zone broadening in HIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262 Resolution in HIC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Influence of experimental parameters in HIC. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 10.3.5 Affinity chromatography, AC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 Retention in AC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 265 Zone broadening in AC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 Resolution in AC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 Influence of experimental parameters in AC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266 10.3.6 Other modes of chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 10.4 Adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267 10.4.1 Adsorption isotherms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269 Linear chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 Non-linear chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271 10.5 Elution Modes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 10.5.1 Frontal chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 10.5.2 Elution chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272 10.5.3 Displacement chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 10.5.4 Sample displacement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 273 10.6 Bed Configuration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 10.6.1 Packed beds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 10.6.2 Fluidized beds. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274 10.6.3 Moving beds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275 10.7 Experimental Determination of Basic Parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 10.7.1 Retention . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 Retention volume, VR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276 Mobile-phase volume, VM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 Mobile-phase composition at elution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 10.7.2 Zone broadening . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 Peak width and plate number . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278 x Contents Residence time distribution, RDT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279 Vessel dispersion number. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280 10.7.3 Resolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 10.7.4 Mass transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 10.7.5 Capacity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 Ionic capacity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 Solute capacity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281 10.8 Modelling of Chromatographic Purifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284 10.8.1 Mass transfer in chromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285 Mass transfer in the mobile phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 Mass transfer in the stationary phase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286 10.8.2 Models for mass transfer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Rate model (mass balance model) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289 Plate model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290 10.8.3 Computer modelling of chromatographic purifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 10.9 Simulation of Separations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 10.9.1 Calculation of process economy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291 10.9.2 Simulations using the supplied software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292 11 Equipment. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299 11.1 Guidelines for Selecting Pilot Plant and Production Chromatography Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299 11.1.1 Dimensioning data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 299 11.1.2 Functional specifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 11.1.3 Chemical specifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 300 11.1.4 Pressure specifications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303 11.1.5 Hygienic design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 11.1.6 Zone spreading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304 11.1.7 Documentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 11.2 Selection of Components . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 11.2.1 Columns . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306 11.2.2 Valves . . .