تجزیه و تحلیل مقایسه ای روش های آماده سازی نمونه برای به کار بردن متابولوم جریان خون پیچیده: هنگامی که حداقل میزان آن نیز زیاد است. Comparative Analysis of Sample Preparation Methods To Handle the Complexity of the Blood Fluid Metabolome: When Less Is More
- نوع فایل : کتاب
- زبان : فارسی
- ناشر : ACS
- چاپ و سال / کشور: 2012
توضیحات
چاپ شده در مجله انجمن شیمی آمریکایی – American Chemical Society
رشته های مرتبط شیمی، پزشکی و زیست شناسی، شیمی تجزیه، میکروبیولوژی، و خون شناسی
برای اینکه با موفقیت با چالش کشف بیومارکر و فرضیه نسل روبرو شویم، روش های تکنولوژی محور مانند متابولومیک ها برای ارائه یک بررسی جامع (انگشت نگاری) همه متابولیت های با وزن مولکولی پایین (LMW) حاضر در سیستم سلولی و زیستی در یک لحظه معین لازم هستند. تکنیک های کروماتوگرافی مایع / اسپکترومتری جرمی (طیف سنجی جرمی) (LC-MS) به عنوان پایدارترین روش برای آزمایش بزرگترین تعداد متابولیت ها در نمونه های زیستی تایید شده اند؛ با این حال، جهانی سازی یک چالش سنگین است هنگامی که تیمارهای نمونه قبل از تجزیه و تحلیل مورد نیاز باشد. آماده سازی نمونه قبل از جداسازی کروماتوگرافی هنوز یک مرحله تحلیلی مستعد خطا و زمان بر است، به ویژه هنگامی که ماتریس های زیستی پیچیده مانند جریان های خون وجود داشته باشد. درنتیجه، در حال حاضر، هیچ تکنیک جهانی مناسب برای آماده سازی نمونه جریان خون بکار رفته برای انگشت نگاری متابولومیک وجود ندارد. از بین بردن پروتئین حداقل تیمار نمونه مورد نیاز قبل از تجزیه و تحلیل، برای حفظ سلامت سیستم LC-MS و کاهش شدید اثرات زمینه ( ماتریس ) است، و بطور معمول از طریق آماده سازی با حلال آلی ، از بین بردن پروتئین، ( با استفاده از حرارت یا اسید ) ، یا از طریق تکنیک های بر پایه غشا مانند تصفیه بسیار زیاد بدست آمده است. با وجود این، تکنیک های آماده سازی نمونه معمولی که انجام می شوند به حساب نمی آورند که، علاوه بر پروتئین ها، ترکیبات دیگر آندوژن ( درون زاد ) برای نمونه های زیستی یک چالش اصلی در روش های تحلیلی زیستی LC-ESI-MS هستند. بالاتر از همه، گونه های فسفولیپیدی ( بطور عمده گلیسروفسفوگلیکان ها ، فسفولپیدهای اصلی در پلاسما ) ممکن است در پوشش متابولیت LMW و تکرار پذیری ، به ویژه برای ترکیبات قطبی لطمه وارد کنند، بنابراین تنوع زیستی پنهان کنند. در غیاب گرادیان مناسب فاز متحرک ، آنها در ستون تحلیلی ( تسریع تخریب ستون) تجمع می یابند و به کندی از ستون در جریان های تحلیلی بعدی ، همراه با متابولیت های دیگر ( افزایش تدریجی خط پایه اختلال، القا اثرات زمینه، تغییر مشخصه های جداسازی) آزاد می شوند. فسفولیپیدها همچنین به علت سرکوب یونی و افزایش پدیده ها، برای اثر نامطلوب بر دقت جرم گونه های کمک شوینده ( به ویژه در ES+) ، برای تعامل با متابولیت های LMW دیگر و اغلب برای ارائه متغیرهای اختلال، با توجه به جنسیت قابل توجه آنها ، فردی یا حتی تنوع مربوط به زمان در خون شناخته شده اند. علی رغم این ملاحظات، حذف آنها از جریان های خونی قبل از تجزیه و تحلیل متابولیک بی هدف هنوز در بررسی نشده است. هدف اصلی مطالعه حاضر بررسی اثرات مشترک و و روش های پیشنهادی جدیدبرای استخراج پلاسما و سرم، از طریق کاربرد یک qToF-MS بر پایه جریان متابولومیک است. اثرات سه حلال معمولی بر پایه روش های آماده سازی پروتئین، یک تکنیک بدون حلال بر پایه غشا، و ترکیب حلال پروتئین زدایی با حذف فسفولیپیدها از لحاظ کارایی استخراج، حداقل کردن اثرات زمینه، و تکرار پذیری استخراج، در چارچوب دو مطالعه متابولیسم تغذیه ارزیابی شدند. جنبه های عملی دیگر، مانند سرعت روش، پیچیدگی و سازگاری با خودکار شدن در نظر گرفته شدند. تجزیه و تحلیل داده های شیمومتری شامل مقایسه های روش داخلی مستقل، تجزیه و تحلیل ( متا ) درجه دوم در داخل روش، و تعریف ساختاری کمک کننده از لحاظ محاسبات رژیم غذایی مرتبط با نامزدهای بیومارکری می باشد.
رشته های مرتبط شیمی، پزشکی و زیست شناسی، شیمی تجزیه، میکروبیولوژی، و خون شناسی
برای اینکه با موفقیت با چالش کشف بیومارکر و فرضیه نسل روبرو شویم، روش های تکنولوژی محور مانند متابولومیک ها برای ارائه یک بررسی جامع (انگشت نگاری) همه متابولیت های با وزن مولکولی پایین (LMW) حاضر در سیستم سلولی و زیستی در یک لحظه معین لازم هستند. تکنیک های کروماتوگرافی مایع / اسپکترومتری جرمی (طیف سنجی جرمی) (LC-MS) به عنوان پایدارترین روش برای آزمایش بزرگترین تعداد متابولیت ها در نمونه های زیستی تایید شده اند؛ با این حال، جهانی سازی یک چالش سنگین است هنگامی که تیمارهای نمونه قبل از تجزیه و تحلیل مورد نیاز باشد. آماده سازی نمونه قبل از جداسازی کروماتوگرافی هنوز یک مرحله تحلیلی مستعد خطا و زمان بر است، به ویژه هنگامی که ماتریس های زیستی پیچیده مانند جریان های خون وجود داشته باشد. درنتیجه، در حال حاضر، هیچ تکنیک جهانی مناسب برای آماده سازی نمونه جریان خون بکار رفته برای انگشت نگاری متابولومیک وجود ندارد. از بین بردن پروتئین حداقل تیمار نمونه مورد نیاز قبل از تجزیه و تحلیل، برای حفظ سلامت سیستم LC-MS و کاهش شدید اثرات زمینه ( ماتریس ) است، و بطور معمول از طریق آماده سازی با حلال آلی ، از بین بردن پروتئین، ( با استفاده از حرارت یا اسید ) ، یا از طریق تکنیک های بر پایه غشا مانند تصفیه بسیار زیاد بدست آمده است. با وجود این، تکنیک های آماده سازی نمونه معمولی که انجام می شوند به حساب نمی آورند که، علاوه بر پروتئین ها، ترکیبات دیگر آندوژن ( درون زاد ) برای نمونه های زیستی یک چالش اصلی در روش های تحلیلی زیستی LC-ESI-MS هستند. بالاتر از همه، گونه های فسفولیپیدی ( بطور عمده گلیسروفسفوگلیکان ها ، فسفولپیدهای اصلی در پلاسما ) ممکن است در پوشش متابولیت LMW و تکرار پذیری ، به ویژه برای ترکیبات قطبی لطمه وارد کنند، بنابراین تنوع زیستی پنهان کنند. در غیاب گرادیان مناسب فاز متحرک ، آنها در ستون تحلیلی ( تسریع تخریب ستون) تجمع می یابند و به کندی از ستون در جریان های تحلیلی بعدی ، همراه با متابولیت های دیگر ( افزایش تدریجی خط پایه اختلال، القا اثرات زمینه، تغییر مشخصه های جداسازی) آزاد می شوند. فسفولیپیدها همچنین به علت سرکوب یونی و افزایش پدیده ها، برای اثر نامطلوب بر دقت جرم گونه های کمک شوینده ( به ویژه در ES+) ، برای تعامل با متابولیت های LMW دیگر و اغلب برای ارائه متغیرهای اختلال، با توجه به جنسیت قابل توجه آنها ، فردی یا حتی تنوع مربوط به زمان در خون شناخته شده اند. علی رغم این ملاحظات، حذف آنها از جریان های خونی قبل از تجزیه و تحلیل متابولیک بی هدف هنوز در بررسی نشده است. هدف اصلی مطالعه حاضر بررسی اثرات مشترک و و روش های پیشنهادی جدیدبرای استخراج پلاسما و سرم، از طریق کاربرد یک qToF-MS بر پایه جریان متابولومیک است. اثرات سه حلال معمولی بر پایه روش های آماده سازی پروتئین، یک تکنیک بدون حلال بر پایه غشا، و ترکیب حلال پروتئین زدایی با حذف فسفولیپیدها از لحاظ کارایی استخراج، حداقل کردن اثرات زمینه، و تکرار پذیری استخراج، در چارچوب دو مطالعه متابولیسم تغذیه ارزیابی شدند. جنبه های عملی دیگر، مانند سرعت روش، پیچیدگی و سازگاری با خودکار شدن در نظر گرفته شدند. تجزیه و تحلیل داده های شیمومتری شامل مقایسه های روش داخلی مستقل، تجزیه و تحلیل ( متا ) درجه دوم در داخل روش، و تعریف ساختاری کمک کننده از لحاظ محاسبات رژیم غذایی مرتبط با نامزدهای بیومارکری می باشد.
Description
■ EXPERIMENTAL SECTION An overview of the sample preparation and the metabolomic workflow applied for comparative analysis is shown in the Supporting Information (Figure S-1). Solvents and Reagents. All aqueous solutions were prepared using ultrapure water obtained from a Millipore Milli-Q Gradient A10 system (Millipore, Bedford, MA, USA). HPLC-grade methanol, o-phosphoric acid (85%), and formic acid were purchased from Scharlau Chemie S.A. (Barcelona, Spain), and LC-MS-grade acetonitrile 0.1% formic acid was purchased from Fluka. The following chemicals were obtained commercially: D-L-carnitine, L-phenylalanine, L-tryptophan, glycochenodeoxycholic acid, gallic acid, syringic acid, (−)-epicatechin, leucine, isoleucine, palmitic acid, acetylcholine chloride, acetyl-L-carnitine hydrochloride, 1-O-palmitoyl-snglycero-3-phosphocholine, 1-O-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, α-hydroxybutyric acid (Sigma−Aldrich, St Louis, MO), 4-hydroxyhippuric acid (PhytoLab GmbH & Co. KG), and naringenin (Extrasynthese, Genay, France). ̀ Aqueous 16-Component Metabolite Mix. An aqueous 16-component metabolite standard mix of biologically relevant compounds was prepared, including three amino acids, two carnitines, three organic acids, two acyl glycine conjugates, an ester of acetic acid and choline, a fatty acid, two lysophosphatidylcholines and two flavonoid compounds (details are given in the Supporting Information). The standard mix was used for data quality control, to monitor mass accuracies, retention times, signal intensities, and eventual drifts in instrumental sensitivity, and to evaluate the ability of each sample preparation method to highlight differences among unspiked, spiked, and differently spiked biological samples.
